信帆生物帶您走進(jìn)免疫熒光技術(shù)

上海信帆生物提供免疫熒光檢測(cè)服務(wù)，檢測(cè)周期短，技術(shù)穩(wěn)定，操作細(xì)致，有需要的可以咨詢我們！

_免疫熒光

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。

技術(shù)特點(diǎn)：

該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完*，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。

熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡(jiǎn)便，便于推廣。國(guó)外生物試劑的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生物試劑。

由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣，在研究檢驗(yàn)中應(yīng)用。

原理：

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反

直接法：

將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢

間接法：

如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為抗體，其它步驟的抗原檢查相同。

標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。

⑴熒光物質(zhì)1）熒光色素許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm，大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用廣泛的熒光素。

其主要優(yōu)點(diǎn)是：

①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，

②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。

⑵四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：大吸收光波長(zhǎng)為570nm，大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈橘紅色熒光。

⑶四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：大吸引光波長(zhǎng)為550nm，大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。

⑵其他熒光物質(zhì)1）酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。

例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等。

2）鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。

常見熒光：熒光素1)FITC2)RB2003)TRITC4）鑭系：Eu、Tb5)PE6）其它常見熒光素的特性

1)FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。

2)RB200：橘紅色粉末，吸收光570nm，發(fā)射光595~600nm，橘紅色熒光。

3)TRITC：紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光620nm，橙紅色熒光。

4）鑭系：Eu、Tb

5)PE：吸收光490~560nm，發(fā)射光595nm，紅色熒光。

6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。酶作用生物質(zhì)酶   底物   產(chǎn)物  激發(fā)光 發(fā)射光Β-G  MUG    MU     360    450AP   MUP    MU     360    450HRP  HPA   二聚體   317    414⑷合適熒光素的選擇

1）具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。

2）熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。

3）熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明。

4）標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性

5）標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、快速。

6）安全無毒

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