PCR實驗代測的模板濃度

 服務(wù)內(nèi)容：

1.制定個性化實驗方案：根據(jù)不同的實驗?zāi)康拇_定實驗方案、選定合適的內(nèi)參；

2.檢測類別：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；

3.樣本抽提及質(zhì)檢：對客戶提供樣本進(jìn)行RNA抽提，并利用NanoDrop進(jìn)行樣本質(zhì)檢；

4.定量PCR預(yù)實驗：包括樣本反轉(zhuǎn)錄為CDNA、配置PCR反應(yīng)體系及進(jìn)行Real-TimePCR反應(yīng)；

5.正式定量PCR實驗：根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果進(jìn)行正式實驗；

6.數(shù)據(jù)分析：采用2- △△CT法進(jìn)行分析，比較不同樣本間差異。

影響Ct值的關(guān)鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間

反應(yīng)液成分的影響

任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應(yīng)的效率

PCR反應(yīng)的效率也會影響Ct值。在PCR擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增，與PCR擴(kuò)增效率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實驗、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。

Real-time qPCR常見參數(shù)

基線（baseline）通常是3-15個循環(huán)的熒光信號

同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線

閾值（threshold）

自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍

手動設(shè)置：置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強(qiáng)

同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴(kuò)增一定要用同一個閾值。

Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。

分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。

△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果（△Rn=Rn-基線）。

如何評估實時定量PCR反應(yīng)的效果

PCR擴(kuò)增效率：為了正確地評估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。

另一個評估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2，它是說明兩個數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計學(xué)術(shù)語。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準(zhǔn)確預(yù)測X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過Y值來預(yù)測X值。R2值大于0.99 時，兩個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。

PCR實驗代測的模板濃度