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更新時間：2013-12-06 
瀏覽次數：3034短讀取的 RNA-seq 雖然可以計數已表達的轉錄本，但無法提供這些轉錄本的結構信息。
現在，斯坦福大學研究人員在《自然-生物技術》（Nature Biotechnology）雜志上報告稱，他們開發出了一種能保留轉錄本結構信息的新方法，他們通過環狀 cDNA 模板和長讀取測序，實現了對轉錄異構體（transcript isoform）的定量和分析。
在這項研究中，科學家舍棄了傳統的短讀取 RNA 測序法，利用 PacBio 公司提供的長讀取技術來測序完整的轉錄本。他們在 20 個人體組織的混合樣本中，鑒定得到了 476,000 個轉錄本序列，平均長度 1 kb。
絕大多數哺乳動物的基因，不符合一基因一轉錄本的模式。這些基因往往存在多種剪切形式，擁有可變的轉錄起始/終止位點。短讀取的測序技術不能提供上述信息，舉例來說，短讀取可以檢測到發生選擇性剪切的外顯子，但無法判斷外顯子之間的結構關系，是包含在同一個轉錄本中還是各自獨立出現。
理論上，長讀取測序技術可以克服這樣的限制。研究人員構建了由環狀cDNA模板組成的SMRTbell文庫，并將其用于測序。由于測序平臺的讀取長度實際上比這些 cDNA 長，該系統可以對每個堿基讀取多次，沿著圓環不斷進行，生成更為的“環化一致序列”（circular-consensus sequence CCS）。在這項研究中，平均讀取長度達到 7 kb，絕大多數 cDNA 堿基被測序了 5-15 次。
研究人員鑒定得到的絕大多數是全長轉錄本，但也并不*。這是由于 PacBio 測序讀長和 cDNA 合成效率的限制，而這兩個因素都受序列長度的影響。
論文的主要作者 Michael Snyder 表示：““對 1.5 kb 以下的 cDNA 來說沒什么問題，對于大部分2-2.5 kb的cDNA來說，也可以鑒定到全長，”作者寫道。“更長的轉錄本需要參考，質量較低但更長的讀取數據。”總的來說，研究人員獲得了 476,000 個CCS，代表著 476 million 堿基。
研究人員將這些轉錄本，與 GENCODE 項目鑒定的 mRNA 進行比對，確定了約 14,000 個全長的轉錄異構體（包括編碼和非編碼的轉錄本），其中有10%是前所未見的。Snyder 表示：“這類研究就好比是盲人摸象，而我們看到了更完整的圖像。”
這項研究中的方法可以用于 RNA 的結構分析和定量。不過，西班牙科學家 Roderic Guigo （未參與該研究）認為，單純從實用性和經濟性考慮，這一方法主要適用于前者，因為在真實樣本中為各轉錄異構體計數是很昂貴的。
麻省理工學院的 Chris Burge 教授（未參與該研究）評價道：“該方法有望在轉錄異構體水平全面注釋基因組，揭示轉錄本的詳細結構信息。”
這項研究可以幫助人們解決一些轉錄本難題，例如判斷相距較遠的選擇性外顯子剪切是否相互關聯。不過 Burge 也指出，許多人類轉錄本實際上超過 2 kb，這一技術還有待進一步改進，以處理更長序列。
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