信帆生物代理銷售ELISPOT試劑盒，解析其原理、步驟和發展！

在免疫學領域中，對于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應答(B細胞免疫)，細胞介導的免疫應答(cell mediated immune response，CMI)也是人們所關注的，而T細胞在CMI中起關鍵作用。在研究免疫應答機制時以往常用用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測體液中游離的細胞因子(CK)或抗體，但由于游離的循環抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合，而不能確切的反映體內的抗體及CK的水平。 80 年代，國外的科研工作者根據 ELISA 技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和 CK 分泌細胞的固相酶聯免疫斑點技術( ELISPOT )。作為一項新型的免疫酶技術——酶聯免疫斑點法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是從單細胞水平檢測分泌抗體細胞(ASC) 或分泌細胞因子(CK) 細胞的一項細胞免疫學檢測技術。由于該方法具有較高的特異性和敏感性，易操作，成本相對流式細胞分析術也較低，已被廣泛用于分泌CK細胞檢測或ASC測定中，對探索自身免疫系統疾病發病機制具有重要意義。

Elispot 法源自 ELISA，又突破傳統 ELISA 法，是定量 ELISA 技術的延伸和新的發展。兩者都是檢測細胞產生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們zui大的不同在于：

(1) elisa通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。

(2) ELISPOT也是通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數斑點或通過ELISPOT 分析系統對斑點進行計數，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。(某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率)

由于是單細胞水平檢測， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體為高親和力、高特異性、低內毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。

原理

ELISPOT就其原理來說實在是很簡單的，從本質上說和ELISA的原理是一樣的，理解起來并不難。細胞受到刺激后局部產生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出現“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子，通過ELISPOT 酶聯斑點分析系統對斑點的分析后得出結果。傳統的ELISA與ELISPOT都是根據酶免疫學檢測原理，通過酶的高催化頻率，放大反應效果，從而達到很高敏感度的檢測效果。

ELISPOT全名為enzyme-linked Immunospot Assay，其技術原理與ELISA相似。其實驗設計是在96微孔培養盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性(不含sodium azide、內毒素endotoxin)的單株抗體。靜脈血PBMC細胞經適當分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當的抗原刺激，并將微孔盤放置于溫箱中過一夜培養一段時間。一般而言，記憶型T細胞在受抗原刺激數小時后會開始分泌細胞激素，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞激素會被 PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素(Biotin)標記的二次抗體來標志，其后再以結合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質使其呈色，有反應作用的細胞會留下染色斑點。

反應步驟可大致分為：

(1) 利用特定細胞因子的單克隆抗體包被96孔板，封閉剩余的空白位點;

(2) 加入細胞懸液，用特異性抗原刺激、活化細胞，產生細胞因子，細胞因子會往附近擴散與之前包被的抗體進行特異結合;

(3) 洗掉細胞;

(4) 加入酶標二抗特異與細胞因子進行結合，通過底物的顯色反應，一個細胞所在位置就會顯出斑點，zui后利用顯微鏡或者特定的讀板機(reader)就可以計算出樣品中被激活細胞的數目。

以上是檢測分泌細胞因子細胞的流程，如果是檢測分泌特異抗體的細胞只需把包被特異抗體變為包被特異抗原即可。

ELISPOT技術的發展

(1) ELISPOT技術的過去

ELISPOT是20多年前便己研發成功的老技術。Czerkinsky 等人在1983年，運用該技術成功地檢測出因受激而分泌抗體的B細胞頻率。從那時起世界各國免疫學者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術競賽，每個團隊都希望能將此一技術推廣來研究T細胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內實驗的環境，藉由偵測T細胞分泌的各類細胞因子，來定量機體內免疫反應啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時預測體內免疫系統即將進行的下游免疫反應。

ELISPOT Cytokine技術雖說操作簡單，但該技術并沒能如預期地很快地被成功應用在ex vivo T細胞功能研究。要讓ELISPOT技術從B細胞免疫走向T細胞免疫的產生的*個主要問題，便是靈敏度的提升，因為T細胞因子較之B細胞免疫球蛋白產量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質、呈色底膜的材質等幾個技術性的問題，使當時多數研究團隊很難獲得清晰的斑點，結果是敏感度不夠、數據分析重現性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應用(Forsthuber et al., Science, 1996)，才釜底抽薪地解決了該技術因斑點呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標準膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細胞分泌的各類細胞因子能在細胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清晰、對比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜(Panel A)與傳統標準薄膜(Panel B)并行實驗的比較結果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過*相同的實驗，Panel A呈現較清晰的小色點。

第二個技術性問題是ELISPOT Cytokine實驗分析的幾個基本假設缺乏科學實證，也使得該技術在當時并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎但很重要的問題，諸如;

實驗所得的斑點是抗原特定T細胞所生物試劑，還是旁觀細胞受Cytokine刺激的次級效應?

斑點的小或大有何生理意義;如何決定cutoff值?

能否相信斑點是由單一的細胞造成?

ELISPOT Cytokine分析技術能準確測量的頻率范圍?

如果效應相互拮抗的cytokine同時產生，它們是否會互相妨礙?及到什么程度?

(2) ELISPOT 技術的現在

1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術改良，ELISPOT 分析技術已經逐漸達到科研人員的期待，它已是當世*zui靈敏抗原特定T細胞的體外檢測技術。藉由檢驗新鮮分離PBMC細胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術可提示T細胞免疫系統的兩個重要參數：抗原特定T細胞的clone族群大小;和免疫效應細胞的信號傳導路徑Th1/Th2。

多年來經過數十個研究團隊的致力研究，對于ELISPOT分析技術本身的幾個問題，也有了科學上的驗證。目前一般*，ELISPOT技術允許科研人員在單細胞水平上識別抗原特定T細胞，主要針對經由CD4或者CD8細胞的免疫反應。在適當的實驗設計下，ELISPOT Cytokine 斑點的數量分析顯示斑點是由一個單細胞所生成，同時斑點形態學與Time Response分析則顯示斑點直徑大小直接反映該細胞族群的產能。也因為如此，ELISPOT是個免疫學上的標竿技術，它可以允許科研人員在幾乎自然生理條件下，觀察細胞實際分泌Cytokine的進程，進而可以得到藥理學信息，闡明免疫調節藥物如何影響T細胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制 T細胞免疫一般可通過兩程截然不同的機轉;使能分泌Cytokine的Precursor T細胞族群變小，或減少每Precursor T細胞的cytokine產能，而ELISPOT技術能提供雙份信息。

ELISPOT分析技術的幾個特點已經讓它在抗原特定T細胞免疫學上*。此技術是當世*準許百萬分之一1:1000,000的準確分析，如此強效的解析力使流式細胞技術也望其項背，以目前國內外常規的 intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對T細胞免疫學研究是必須的，因為抗原特定T細胞一般在機體周邊循環系統發生的頻率通常低于萬中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術被證實適用于冰凍后復蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當的效價，沒有喪失功能。這一點對研究試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的樣本血樣，如果試驗牽涉全國多個研究試驗機構，樣本血樣可冰存并同時集中在「中央實驗室」一齊被測試。同理，一個血樣或標準對照品可被分裝小份，被送到不同檢驗中心進行測試，以交互比對，同時有利LISPOT Cytokine技術流程的規范化、標準化。

(3) ELISPOT 未來展望

ELISPOT 分析技術正在歐美各國發揮它的完整潛能，它讓免疫學家可以直接洞察活體內T細胞相關生理學或病理學，就像是心臟外科醫師手上的那張心電圖，經由這個技術科研人員可以在活體內直接進入一個器官系統，在那里視察、發掘，得到全新的智識。

從各國文獻可見ELISPOT技術已經達到標準化、規范化的要求，并被廣泛地應用在多項領域，包括監視癌癥樣本接受免疫療程時的反應(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、腫瘤(Nagorsen, 2000)、或自體免疫樣本體內的一個特定的免疫反應型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技術同時也在數個疫苗效價評估人體試驗中，被當成重要的終結指針。2003年1月，世界衛生組織通過與大陸北京性艾中心合作，將應用ELISPOT技術來監測HIV疫苗研究免疫應答反應技術，該計劃將是利用ELISPOT技術對亞洲國家從事HIV疫苗研究和研究試驗的有關研究。我們期待未來此一技術能在我國免疫學界得到廣泛地應用。