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更新時間：2016-02-24 
瀏覽次數：3012信帆生物為您分享：MTT實驗zui全指南
一、MTT是什么
MTT是一種粉末狀化學試劑，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。
二、mtt法用來做什么
簡單地說：是一種檢測細胞存活和生長的方法。
MTT主要有兩個用途
1.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養的細胞毒性的測定;
2.細胞增殖及細胞活性測定。
三、為何MTT可以用來做上述工作
檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值(OD值)，來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強(如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小)。
四、實驗所需材料
1.MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。
市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g
1.1對于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個人建議不要再用天平稱量分裝，而應該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。 具休做法：預先在50ml離心管(沒有的話，可用培養瓶替代)加入20ml PBS，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻。可以重復幾次，以使小管中的MTT不殘留于管內。將MTT*混勻后，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細胞培養板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時可考慮每管分裝1ml。
1.2對于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加。
注意事項：
l在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。
l配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感
lMTT一般現用現配，過濾后4度避光保存兩周內(個人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當MTT變為灰綠色時就不能再用。
lMTT有致癌性，用的時候小心,有條件帶那種透明的簿膜手套.
2.MTT甲瓚溶解液
2.1二甲基亞砜DMSO，可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養液，在去除培養液的過程中，可能會把結晶去掉，導致結果不穩定。
2.2三聯溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液(文獻方法：周建軍等，評價抗癌物質活性的改良MTT方法，中國醫藥工業雜志，1993，24(10)：455-457)，該溶解液不需去除原培養基，但溶解較慢。(個人覺得其溶解的能力不如DMSO強)
該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用。
五、MTT法實驗步驟
1: 胰酶消化對數期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數調整其濃度至5-10×104/ml。
細胞詳細計數方法請參照易生物實驗技術中的相關文章。
對于初學者而言，要使細胞達到5-10×104/ml往往不知從何處著手，我在這里向大家提供一個簡單的方法以初步確定細胞數量。
以一般細胞培養常用的25cm2為例，
1)細胞密度在長到約80%~90%(下圖所示為80%~90%密度時細胞的大致狀態)，消化離心收集后，將上清去掉，加入3ml培養基使其混勻。
2)另取一支新的15ml無菌離心管(為下一步接種96孔板用)，裝入約9ml培養基.
3)從*步準備的3ml細胞懸液中取1ml, 加入上管，混勻后細胞計數，此時一般為或小于5-10×104/ml，該濃度相當于細胞計數板4個大格內每大格平均5-10個細胞(見下圖);如果不夠該濃度，再根據計數的結果滴加細胞懸液，每滴按50ul計算。
4)細胞數量因實驗目的不同應做相應調整，如一般細胞增殖實驗每孔2000個就可以(相當于細胞懸液密度為2×104/ml)，細胞毒性實驗每孔5000—10000個(相當于細胞懸液密度為5×104/ml)。此外，還應根據細胞本身特性，如生長快慢，來決定細胞數量。比如：生長較快的細胞密度可略小。
2.將細胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為5000—10000/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。
l注意：因細胞在混勻后仍要繼續沉降，因此接種的過程中要反復多次混勻，如每加6個孔就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間*相同，這對于MTT的結果至關重要。
3.將接種好的細胞培養板放入培養箱中培養，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設6個，否則難以反應真實情況。下圖可做為96孔板的的參考步局。
l對于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認為應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將96孔板中的培養上清去掉(可以用排槍吸走)再加入100ul含不同濃度藥物的培養基，這樣能保證藥物濃度的準確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養液全部吸走后再加藥，應該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥引起細胞死亡。
4.5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥物梯度為細胞的毒性作用。
5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。
6. 終止培養，準備溶解結晶。
l 溶解結晶的方法有兩種，*種，用DMSO溶解
1) MTT加入培養4h后，結晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌面，然后將96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結果的損失。個人認為，這兩種方法都有可能導致結晶的損失，從而引起結果的不準確。采用哪種方法，可以自己摸索一下再決定。
2) 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
l 另一種方法，用三聯溶解液(見上面MTT甲瓚溶解液)
1) MTT加入培養4h后，結晶可充分形成。這種方法細胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。(該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用。)
2) 放入培養箱中繼續孵育4—6小時，鏡下觀察，待結晶全部溶解后570nm測吸光度。通常37℃孵育4小時左右，紫色結晶會全部溶解。如果紫色結晶較小較少，溶解的時間會短一些。如果紫色結晶較大較多，溶解的時間會長一些。
在實際的操作過程中，往往為了等待4—6小時，使得實驗者在下班以后或者晚上來測OD值，給實驗者帶來了很大的不方便。個人曾經摸索，加入溶解液后過一夜再測對OD值基本無影響，但要注意的是一定要避光，不過培養箱關閉后本身就是閉光的，所以加入溶解液后放入培養箱中，第二天上班時再測OD值就可以了。
7、同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)。
六、MTT結果分析
關于如何計算IC50
1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg zui大劑量
I:lg(zui大劑量/相臨劑量)
P:陽性反應率之和
Pm:zui大陽性反應率
Pn:zui小陽性反應率
舉個例子：各藥物濃度作用于某腫瘤細胞后所得MTT值如下
藥物濃度ug/ml
100 50 25 12.5 6.25 3.125 0
OD均值
0.080 0.093 0.236 0.374 0.441 0.531 0.614
公式中的zui大zui小陽性反應率就是zui大zui小抑制率
抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值，如對于100ug/ml的藥物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各組抑制率如下：
藥物濃度ug/ml
100 50 25 12.5 6.25 3.125
抑制率
0.869 0.849 0.616 0.391 0.282 0.135
代入計算公式：
Pm=0.869
Pn=0.135
P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142
Xm=lg100=2
lgI=lg100/50=0.301
lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655
IC50=45.186
該藥物的IC50值為45.186ug/ml
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