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更新時間：2016-06-06 
瀏覽次數(shù)：1377細胞凋亡一直都是細胞生物學研究的熱點，這個復(fù)雜的過程涉及多條通路，可以用多種方法在不同的階段進行檢測。細胞凋亡晚期，細胞核發(fā)生形態(tài)變化、染色質(zhì)凝聚、核膜降解、DNA片段化。
TUNEL（脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的缺口末端標記法）是檢測DNA片段化的成熟方法，自1992年發(fā)表以來經(jīng)過不斷改進，縱橫實驗室逾20年，至今仍然是廣泛采用的凋亡檢測方法，這是因為TUNEL能夠與其他細胞學技術(shù)很好的契合。比如，使用TUNEL分析進行凋亡研究有一個好處，研究人員在TUNEL法標記細胞之后，在直接檢測和定位凋亡信號的同時，還可以通過抗體在同一個樣本上檢測細胞表面和細胞內(nèi)的生物學指標。
TUNEL的基本原理：DNA斷裂時會產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將生物素或熒光素或digaoxin標記的dUTP摻入到DNA的3'-末端，可通過一定的顯色系統(tǒng)使之顯示出來。過去，TUNEL算得上是個值得“用心摸索”的試劑盒，因為有點技術(shù)難度。如今市場上的TUNEL檢測產(chǎn)品有了哪些改進和新選擇呢？
考慮通透性和標記
TUNEL檢測的一個關(guān)鍵要素是把握好細胞透化的時間。透化的目的是通透細胞膜和核膜，通俗說就是在膜上打孔，讓反應(yīng)試劑得以充分進入細胞核進行反應(yīng)，提高檢測效果。門開小了大家俬不好進場，若透化不足可能檢測不到凋亡的特征，造成假陰性?？砷_孔太過又影響形態(tài)，透化時間太長還容易脫片。
DNA的標記是另一個重要的影響因素。標記分子太大則不利于TdT將其摻入DNA片段。早期的分析中dUTP通常用生物素或熒光素標記，由于熒光基團的“大塊頭”，使得其標記的dUTP摻入DNA的效率要低于預(yù)期。后來改進為利用Br-dUTP來取代生物素或熒光素標記的dUTP，因為溴分子比熒光素、生物素等標記物要小得多，因此Br-dUTP更容易被摻入凋亡細胞的DNA片段中，再經(jīng)過Br-dUTP抗體識別、以及抗體上偶聯(lián)的生物素或熒光素放大或顯色，使得zui后的檢測信號也更強。但是，Br-dUTP要用抗體檢測，要求嚴謹?shù)姆磻?yīng)條件。
更好的選擇是EdUTP，這種以炔烴基團（一種小分子基團）修飾的dUTP比Br-dUTP更小，更容易被TdT摻入到DNA末端。更妙的是，EdUTP的檢測不需要經(jīng)過抗體，而是通過一步高度特異性的click反應(yīng)（一種銅催化的疊氮化物與炔烴之間的反應(yīng)），將摻入DNA的EdUTP上的炔烴基團，與疊氮化合物（偶聯(lián)生物素或熒光素）共價連接，再借助疊氮化物上的生物素或熒光標記，可實現(xiàn)靈敏的TUNEL檢測。與BrdU抗體（分子量約為150 kDa）相比，這個疊氮化物的大小僅為1%（分子量<~1000 Da），通透性要好得多。
click技術(shù)的優(yōu)勢在于疊氮化物和炔烴都是極小的惰性基團，因此，只需要溫和的固定和透化條件，即可達到讓試劑充分滲透進入細胞核。同時，高度特異的click反應(yīng)可實現(xiàn)更低的背景干擾，和更穩(wěn)定的共價結(jié)合產(chǎn)物，從而更好地檢測凋亡細胞。此外，升級版的Click-iT Plus技術(shù)無需銅的參與，染料兼容性更廣泛，在多色檢測中表現(xiàn)更出色。
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