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免疫熒光五標六色（切片）服務介紹：免疫熒光五標即利用酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技術，在同一張切片上對五種蛋白同時進行標記，從而可實現(xiàn)對多種蛋白空間定位，定性及半定量分析。
產(chǎn)品型號：廠商性質：生產(chǎn)廠家更新時間：2024-11-21訪 問 量：1210
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免疫熒光五標六色（切片）
服務介紹：
免疫熒光五標即利用酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技術，在同一張切片上對五種蛋白同時進行標記，從而可實現(xiàn)對多種蛋白空間定位，定性及半定量分析。
TSA技術主要原理為熒光標記的酪胺在二抗上偶聯(lián)的HRP與H2O2的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街诎袠酥車牡鞍桌?氨酸殘基上，此結合是共價結合。而一抗與靶標、二抗與一抗之間是非共價結合。通過抗體洗脫液處理，非共價結合的一抗二抗被洗脫掉，而共價結合的熒光酪胺依然附著在靶標周圍，將靶標通過熒光標記顯示出來。在檢測第二個靶標時，相當于全新的一輪標記，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應。只需改變不同種類熒光染料標記TSA即可實現(xiàn)多個靶標的標記。通過多次重復免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)雙重或多重熒光染色。
名稱 | 規(guī)格 |
免疫熒光五標六色（切片） | 張 |
送樣運輸要求：
1、石蠟切片常溫保存運輸，冰凍切片﹣20℃保存運輸
2、細胞爬片PFA固定15min后用無菌PBS洗滌，無菌PBS浸泡，4℃冰袋保存運輸?shù)綄嶒炇?/span>
實驗大體流程：
石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修復——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第二種一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第三種一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF546-TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第四種一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF594-TSA——抗體洗脫——血清封閉——孵育第五種一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF700-TSA——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像。
（TSA熒光染料的搭配及加樣順序根據(jù)各抗體的表達情況來確定。）
實驗具體流程：
1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。
2、抗原修復：組織切片置于盛滿抗原修復緩沖液（PH 6.0 檸檬酸 PH 9.0 EDTA； PH 8.0 EDTA）的抗原修復盒中于微波爐內進行抗原修復。維持緩沖液沸騰10min左右，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min(修復液種類和修復條件根據(jù)組織來確定，優(yōu)先推薦PH 6.0 檸檬酸修復液）。
3、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走），切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min左右，封閉內源性過氧化物酶。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
4、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。
5、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）。
6、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。
7、加iF440-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF440-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
8、抗體洗脫：切片稍甩干后，滴加抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完-全覆蓋組織，37°C孵育30 min，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
9、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。
10、加第二種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）。
11、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。
12、加iF488-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF488-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
13、抗體洗脫：切片稍甩干后，滴加抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完-全覆蓋組織，37°C孵育30 min，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
14、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。
15、加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）。
16、對應的HRP標記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。
17、加iF546-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF546-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
18、抗體洗脫：切片稍甩干后，滴加抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完-全覆蓋組織，37°C孵育30 min，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。
20、加第四種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）。
21、對應的HRP標記的二抗：將玻片置于P中上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。
22、加iF594-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF594-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
23、抗體洗脫：切片稍甩干后，滴加抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完-全覆蓋組織，37°C孵育30 min，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
24、血清封閉:切片平放于避光濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。
25、加第五種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）。
26、對應的HRP標記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。
27、加iF700-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF700-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
28、DAPI復染細胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
29、自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。
30、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
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